LRRK2-IN-1 CAS 1234480-84-2生物活性

試験管内で

野生型およびG2019S形質導入は、2.5倍高いTR-FRETシグナルをもたらし、これはLRRK2-IN-1IC8値がそれぞれ0.08 µMと0.03 µMの用量依存的な方法で[1]。 LRRK2-IN-1は、DCLK2の阻害について45 nMのIC50を有し、AURKB、CHEK2、MKNK2、MYLK、NUAK1、およびPLK1の生化学的アッセイで評価した場合、1 µMを超えるIC50を示します。 LRRK2-IN-1は、MAPK7を160 nMのEC50で阻害することが確認されています。 LRRK2-IN-1は、HEK293細胞に安定的にトランスフェクトされた野生型LRRK2とLRRK2 [G2019S]の両方への14-3-3結合の喪失を伴う、Ser910とSer935リン酸化の用量依存性阻害を誘発します[2]。 LRRK2-IN-1は中程度の細胞毒性があり、HepG2細胞でのIC50は49.3 µMです。 LRRK2-IN-1は、S9の存在下および非存在下でそれぞれ15.6および3.9 µMで遺伝毒性を示します[3]。 LRRK2-IN-1は、HCT116およびAsPC-1細胞のアポトーシスの特徴を示す増殖、遊走を阻害し、細胞死を誘発します。

In Vivo

LRRK2-IN-1（100 mg / kg、ip）は、マウスの腎臓でLRRK2の脱リン酸化を誘導します[2]。 LRRK2-IN-1（100 mg / kg）の腫瘍周囲注射により、AsPC-1腫瘍異種移植片の腫瘍体積と重量が大幅に減少します[4]。

キナーゼアッセイ

アクティブなGST-LRRK2（1326-2527）、GST-LRRK2 [G2019S]（1326-2527）、GST-LRRK2 [A2016T]（1326-2527）およびGST-LRRK2 [A2016T + G2019S]（1326-2527 ）酵素は、適切なcDNA構築物の一時的なトランスフェクションの36時間後に、HEK293細胞溶解物からのグルタチオンセファロースで精製されます。デュプリケートで実行されるペプチドキナーゼアッセイは、50 mM Tris / HCl、pH 7.5、0.1 mMで0.5 µg LRRK2キナーゼ（これは約10％の純度で8 nMの最終濃度を与える）を含む40 µLの総容量でセットアップされます。 EGTA、10 mM MgCl2、20 µMニクタイド、0.1 µM [γ-32P] ATP（500 cpm / pmol）、および指示濃度の阻害剤がDMSOに溶解。 30°Cで15分間インキュベートした後、35 µLの反応ミックスをP81ホスホセルロースペーパーにスポットし、50 mMリン酸に浸して反応を停止します。サンプルを徹底的に洗浄し、ニクチドへの[γ-32P] ATPの取り込みをチェレンコフカウンティングによって定量化します。 IC50値は、非線形回帰分析を使用してGraphPad Prismで計算されます。

細胞アッセイ

細胞（ウェルあたり104細胞）を3連で96ウェル組織培養プレートに播種します。細胞は、０、０．３１、０．６３、１、２、および５、１０、および２０μＭでビヒクルとしてＤＭＳＯを用いてＬＲＲＫ２－ＩＮ－１の存在下で培養される。処理の48時間後、10μLのTACS MTT試薬を各ウェルに添加し、細胞内で暗色の結晶沈殿物が見えるようになるまで細胞を37°Cでインキュベートします。次に、DMSO中の266 mM NH4OH 100μLをウェルに加え、プレートシェーカーに低速で1分間置きます。振とう後、プレートを遮光して10分間インキュベートし、各ウェルのOD550をマイクロプレートリーダーで読み取ります。結果は平均化され、DMSO（車両）コントロールの割合として計算されます+ /-平均の標準誤差。

動物管理

LRRK2-IN-1カプチゾールに溶解し、100 mg / kgの用量で野生型雄C57BL / 6マウスに腹腔内注射により投与します。対照マウスには、等量のカプチゾールを注射する。 1時間後と2時間後の時点で、マウスは頸椎脱臼によって消火され、腎臓と脳の組織は急速に解剖され、液体窒素で急速冷凍されます。

参考文献

[1]。ハーマンソンSB他LRRK2 Ser935 Phosphorylation.PLoSのハイスループットTR-FRET細胞アッセイを使用した新規LRRK2阻害剤のスクリーニング2012; 7（8）：e43580。 Epub 2012 8月28日。

[2]。 Deng、Xianming。、et al。パーキンソン病GG＃39の選択的阻害剤の特性; s疾患キナーゼLRRK2。 Nature Chemical Biology（2011）、7（4）、203-205。

[3]。コシブK他パーキンソン病GG＃39病の薬理学的研究のためのLRRK2-IN-1の代替。薬理学。 2015; 96（5-6）：240-7。

[4]。 Weygant N、他。小分子キナーゼ阻害剤LRRK2-IN-1は、ダブルコルチン様キナーゼ1。 2014 5月6日、13：103